La cinétique enzymatique

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Dernière mise à jour : 2016-02-01

1. Définitions

Une protéine enzymatique ne rend pas possible une réaction qui ne l'est pas thermodynamiquement.

1.1. Vitesse de réaction

On suit en fonction du temps:

Pour les réactions réversibles, la vitesse de réaction est :

v = d[P]/dt = - d[s]/dt

1.2. Cinétique enzymatique

On étudie :

2. Effet de la concentration initiale de substrat sur la vitesse de réaction

On étudie in vitro l'influence de [S] initiale, les autres paramètres restent constants.
Les courbes obtenues reflètent plusieurs points :

Si l'on étudie les variations des différentes concentrations pour une seule concentration en substrat, on distingue 3 phases.
Les concentrations en substrat (disparition progressive) et en produit (apparition progressive) varient toutes deux linéairement en fonction du temps. Parallèlement, la concentration du complexe ES est constante.
On distingue donc :

La vitesse de réaction sera donc mesurée pendant la phase stationnaire, quand [ES] est constante. Ceci nous permet d'ailleurs d'établir que la concentration en substrat est grande par rapport à la concentration en enzyme.

L'étude des vitesses initiales obtenues à différentes concentrations initiales en substrats permet d'établir que la vitesse initiale croît selon [S] puis atteint un maximum.
Ceci est également observable sur un graphe reportant les vitesses initiales obtenues en fonction des concentrations en substrats.
La courbe correspondante est une hyperbole. Elle présente deux points intéressants pour l'étude cinétique : La Vmax (vitesse maximum de réaction) et la KM. La KM est la concentration en substrat pour laquelle on obtient une vitesse = Vmax/2 . Elle s'exprime en molarité. Elle correspond à l'inverse de l'affinité de l'enzyme pour son substrat.
La vitesse est déterminée selon la formule :

v = (Vmax.[S])/(KM + [S])

Au cours de la réaction chimique on a donc :

E + S <--K1 ou K2--> ES <--K3 ou K4--> EP <--K5 ou K6--> E + P

Vo = K3.[ES], la formation du complexe enzyme-substrat est très rapide. K3 et K4 sont petites devant les autres, l'étape de transformation de ES en EP est instantanée. Il apparaît donc que la transformation de ES en P est l'étape limitante. On peut donc simplifier selon le schéma suivant :

E + S <--K1 ou K2--> ES --K3--> E + P

Quand la Vmax est atteinte, la totalité des enzymes présents sont complexés avec les substrats: [ES] = [Et] et Vmax = K3.[Et]

3. Effet de la concentration d'enzyme sur la Vmax de la réaction

On étudie in vitro l'influence de la [E] sur la vitesse de la réaction.
La vitesse est déterminée selon la formule

v = (Vmax.[S])/(KM + [S])

Pour des concentrations saturantes en substrat ([S] > 10.KM), la vitesse de réaction est proportionnelle à [Et].
La Vmax est ainsi multipliée par deux lorsque la concentration en enzyme est doublée.
La Vmax dépend donc de la concentration en enzyme du milieu.

La KM est inchangée, c'est une constante de la protéine enzymatique. Pour obtenir ses valeurs précises on transforme l'hyperbole obtenue précédemment en une droite inverse selon la représentation de Lineweaver et Burk.
Cela se fait selon la formule suivante :

1/V = (KM/Vmax) x (1/[S]) + (1/Vmax)

4. Notion d'activité enzymatique

Il s'agit de déterminer la quantité d'enzyme présente dans un milieu quel qu'il soit en mesurant la Vmax (avec concentration saturante en substrat). C'est ce qui définit l'activité enzymatique, la Vmax étant directement proportionnelle à la quantité d'enzyme du milieu.

Si le milieu contenant l'enzyme en question est un milieu complexe (non purifié), l'expression des résultats se fera selon un système d'unité arbitraire:
1U.I = transformation d'une micromole de substrat par minute.

Si le milieu est purifié et qu'on connait le poids moléculaire de l'enzyme alors on peut déterminer le nombre de molécules d'enzymes. Le nombre de moles d'enzymes sera égal à quantité de protéine (en grammes) divisée par le PM de l'enzyme (en grammes). C'est ce qui définit l'activité enzymatique moléculaire : nombre de molécules de substrat transformées par minute et par mole d'enzyme.

5. Facteurs influençant la vitesse de réaction

5.1. Facteurs physiques

5.1.1. La température

La loi d'Arrhénius détermine l'influence de l'augmentation de température sur les réactions chimiques.( cf: fiche cinétique chimique )
Une augmentation de température va principalement se traduire par une augmentation des chocs moléculaires efficaces.
Pour une élévation de 10°C, la vitesse d'une réaction chimique est multipliée par 2.

Les courbes concernant les enzymes ne correspondent pas tout à fait aux courbes de la loi d'Arrhénius classique. En effet, passé la température optimale (pic graphique), on observe une baisse progressive de la vitesse de réaction puis on arrive à la température d'inactivation, température pour laquelle l'activité enzymatique est nulle.
Cette courbe se divise donc en deux parties, avant et après le pic de la température optimale. La première partie, courbe ascendante, correspond à la loi d'Arrhénius. La seconde partie, courbe descendante, est le fait de la dénaturation de l'enzyme par sa thermolabilité (fraction protéique).

Chaque enzyme présentera donc une température optimale et une température d'inactivation spécifiques. Par exemple, la maltase aura une activité optimale à 35°C et sera inactivée à 55°C.

Ainsi, pour le dosage d'activités enzymatiques on peut utiliser 3 températures: 25°C, 30°C, 37°C. C'est cette cernière température qui est le plus souvent utilisée.

5.1.2. Le pH

On observe le même phénomène: l'activité augmente, arrive à un pic correspondant au pH optimum, puis décroît. Cependant, la courbe ne débute pas au 0 mais à un pH déterminé. Il correspond au premier pH d'arrêt (pH trop bas), le second pH d'arrêt étant celui où il n'y a plus d'activité (pH trop élevé). Le pH optimum peut-être très acide (2 par exemple pour la pepsine), basique (7,8 pour la trypsine), ou neutre.

Au pH optimum, l'enzyme possède une charge totale MINIMALE

5.2. Facteurs chimiques

Ils peuvent être minéraux ou organiques et modifieront la vitesse de réaction. Ils seront donc activateurs ou inhibiteurs.

5.2.1. Facteurs chimiques activateurs

5.2.1.1. Activateurs vrais

Ce sont les ions métalliques. On trouve très fréquemment ce type d'activateurs dans les réactions de l'organisme (cf catabolisme énergétique). Cet ion n'est donc pas lié à l'enzyme, il en est dissociable. Néanmoins, il est indispensable pour une réaction correctement effectuée, et on peut donc le considérer comme un second substrat.
Par exemple, dans les réactions de phosphorylation catalysée par les kinases, le substrat est le complexe MgATP2- et le véritable produit est le MgADP1-.

Il est également possible d'observer des enzymes dont l'ion métallique fait partie de la structure chimique. Dans ce cas, il n'est pas considéré comme un activateur.

5.2.1.2. Fixation covalente de groupements chimiques

Ce type d'activation par fixation est relatif à des enzymes existants sous deux formes : active et inactive. Cette activation se fera par addition ou perte d'un groupement phosphate.
Les protéines kinases fixeront ce groupement sur des résidus Ser, Thr ou Tyr.
Les protéines phosphatases enlèveront ce groupement.
Ce système d'activation/inhibition joue un rôle prépondérant dans la régulation du métabolisme cellulaire.

5.2.1.3. Activateurs de pro-enzymes

Ce mécanisme irréversible comporte une première étape de synthèse d'un précurseur inactif. Ce pro-enzyme inactif ou zymogène sera ensuite excrété dans le milieu extra-cellulaire et sera clivé pour donner l'enzyme actif.
Par exemple, le trypsinogène synthétisé par le pancréas est excrété dans le tube digestif où il sera clivé et donc activé en trypsine (par le trypsinogène duodénal).

5.2.2. Facteurs chimiques inhibiteurs

Deux types se distinguent :

Il existe trois grands types d'inhibiteurs réversibles :

5.2.2.1. Inhibiteur réversible compétitif

Il présente généralement une homologie structurale avec le substrat. Il entrera donc en rivalité avec lui pour occuper la place du substrat au niveau du site catalytique.
La Vmax ne sera pas modifiée.
L'affinité est diminuée donc la KM augmentée.

5.2.2.2. Inhibiteur réversible non compétitif

Il n'y a pas de rivalité mais cohabitation. L'enzyme fixera à la fois le substrat et l'inhibiteur.
La Vmax est diminuée.
L'affinité et donc la KM ne sont pas modifiées.

5.2.2.3. Inhibiteur réversible incompétitif

L'inhibiteur ne se fixe que sur le complexe enzyme-substrat.
La Vmax est diminuée.
L'affinité est augmentée donc la KM diminuée.


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