Méthodes d'étude des protéines

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Dernière mise à jour : 2016-02-01

Sommaire

Dans ce cours :

1. Bases techniques

1.1. Chromatographie

La chromatographie est une technique de séparation des constituants d'un mélange dans laquelle interviennent des phénomènes d'adsorption et de partage. Le mécanisme général correspond à l'entraînement de ces constituants par une phase mobile (liquide) le long d'une phase stationnaire ou fixe (solide, gel de silice sur plaque aluminium par exemple) contenue dans une colonne. Le solvant de chromatographie de la phase mobile déposé en haut de colonne va descendre par capillarité dans la phase stationnaire entraînant avec lui les composants protéiques. Selon leur hydrophilie, pHi ou encore selon leur P.M ils migreront plus ou moins vite dans la phase fixe.
La chromatographie liquide haute performance ou CLHP (HPLC en anglais) améliore les performances de séparation en mettant la phase mobile sous pression (plus précis, plus rapide). Le dispositif est alors modifié : le diamètre de la colonne est réduit, des pompes sont ajoutées, les phases fixes fixes employées doivent être capables de résister à la pression (donc phase stationnaire en silice).
Dans la chromatographie, ce qui entraîne les molécules est un flux liquidien, naturel ou forcé.

1.2. L'électrophorèse

La migration différentielle de molécules chargées sous l'influence d'un champ électrique constitue la base de cette technique de fractionnement. Les acides aminés sont séparables et identifiables par cette technique par leur dissociation acido-basique.
Le système est composé d'une plaque de verre recouverte de gel d'agarose ou d'acrylamide creusé à un bout de puits recevant les échantillons à étudier. De part et d'autre de cette plaque, se disposent cathode et anode au contact du tampon de migration (solution riche en ions pour la conduction de l'électricité) placé à chaque bout de la plaque. Une différence de potentiel entre les électrodes est réalisée par un courant continu haut voltage.
Plus les composés auront des charges importantes et plus vite ils migreront. A la fin de la migration, il suffit de relever l'emplacement des composés d'aminoacides via des colorants (tels que le bleu de Coomassie) et la distance parcourue (leur déplacement) et de comparer avec des témoins.
Dans l'électrophorèse, c'est un courant électrique qui entraîne les molécules. Seules celles qui sont chargées se déplaceront.

2. Purification de nouvelles protéines

2.1. Préparation de l'extrait protéique

Celle-ci est réalisée quand l'extrait ne provient pas d'une source soluble (sérum, LCR...) mais d'un tissu dont il faut donc extraire un homogénat.

2.1.1. Homogénéisation

Elle peut être réalisée par des homogénéisations mécaniques, l'emploi d'ultrasons, l'utilisation de chocs osmotiques. La lyse des membranes cellulaires ainsi effectuée va permettre la libération du contenu cytoplasmique. Ceci aboutit à l'obtention d'une "soupe cellulaire" qu'il est nécessaire de clarifier par centrifugation pour séparer les protéines solubles, les sels minéraux, les petites molécules (oses, acides aminés, lipides, coenzymes).

2.1.2. Centrifugation, ultracentrifugation

Comme nous venons de la voir, elle permet la séparation des cellules, organites et macromolécules biologiques. Le dispositif comporte un moteur faisant tourner un axe auquel sont fixés des tubes contenant les solutions à clarifier. La vitesse de sédimentation est proportionnelle à l'intensité du champ centrifuge. Le résultat d'une centrifugation est l'obtention de deux fractions : le sédiment ou culot (solide, au fond du tube), le surnageant (fraction liquide). Une sédimentation de 600 à 1000g pendant 10 minutes, dite "simple", permet par exemple d'extraire du sang total les hématies et leucocytes dans le culot, et le plasma en surnageant. Un centrifugation de 15000g permettra la sédimentation d'organites comme les mitochondries. Pour les molécules plus petites telles que les ribosomes, réticulum endoplasmique, il faut monter à 100 000g, le surnageant sera alors le cytosol.

2.1.3. Elimination des petites molécules

La dialyse est la méthode la plus connue. Le dispositif est simple : un bac d'eau distillée contient un sac de cellophane contenant un extrait protéique. Les petites molécules et l'eau vont diffuser à travers les pores du sac.
Les macromolécules comme les protéines sont retenues dans le sac. Les protéines ne sont pas dialysables.
Par la suite, on oberservera le phénomène d'osmose : les petites molécules passeront la memebrane dans un sens permettant l'équilibre des concentrations de part et d'autre de la membrane du sac.

Autre méthode, l'ultra filtration sous pression permet également l'élimination des petites molécules. Le principe est similaire : l'extrait protéique est filtré sous pression d'azote à travers un filtre de cellulose à pores sélectifs.

2.2. Dosage global des protéines

2.2.1. Spectrophotométrie à 280nm

La spectrophotométrie n'est utile que pour les acides aminés aromatiques ( Tyr, Trp) mais d'autres substances peuvent absorber à 280nm.

2.2.2. Réaction du biuret

Les protéines sont placées en milieu alcalin Cu2+ formant un complexe violet proportionnel à la quantité de protéines. C'est en fait les liaisons peptidiques qui sont dosées dans cette technique.

2.2.3. Technique de Lowry

la technique de Lowry, très sensible, ne dose que la tyrosine.

2.2.4. Colorations spécifiques

La coloration dénature les protéines. Divers colorants comme le noir amide, le bleu de bromophénol, le rouge ponceau, le bleu de coomassie se fixent aux protéines. Généralement la coloration est effectuée pour révéler les résultats d'une électrophorèse.

2.3. Méthode basée sur l'hydrophilie / hydrophobie relative des protéines

Il s'agit de la chromatographie de partage. Une molécule composée d'aminoacides présentée à la fois à une phase polaire et à une phase apolaire organique se partagera en deux fractions entre ces deux phases selon son degré d'hydrophilie / hydrophobie déterminant son coefficient de partage. La chromatographie de partage est donc basée sur cette différence d'affinité. Pour faire simple, il faut retenir deux vérités.

  • Plus une protéine possède de groupements polaires, plus elle est soluble dans l'eau.
  • Plus elle possède de groupements apolaires, plus elle est soluble dans les solvants organiques

Les protéines, en chromatographie en phase inverse, iront donc aussi loin que leur affinité pour la phase mobile est élevée.

Le plus souvent en chromatographie de partage des protéines, la phase fixe est hydrophobe et la phase mobile est hydrophile. Les protéines hydrophiles les plus hydrophiles vont être entraînées par la phase mobile et vont donc sortir en premier. Les protéines hydrophobes, retenues par la phase stationnaire, sortiront en dernier.

2.4. Méthodes de séparation basées sur les différences de pHi

2.4.1. Les différences de pHi des protéines

La composition des protéines et peptides les rend susceptibles de porter des charges électriques, ceci suite aux dissociations acido-basique des aminoacides.
Rappelons que (cf cours acides aminés) :

Les protéines auront donc un pHi "somme" de ceux des aminoacides à radicaux ionisables la composant. Le pHi d'une protéine correspond à une moyenne des pHi de tous ses acides aminés.
Ainsi les mêmes propriétés précédemment énoncées sont valables pour des protéines :

2.4.2. Electrophorèse simple

Seul le pHi apparait comme critère de séparation.
L'application de ce principe correspond à l'électrophorèse dite "de zone" ou sur support solide (cf. Electrophorèse, §1.2.) révélée par coloration. Les protéines fixées et colorées seront dénaturées irréversiblement.

2.4.3. Chromatographie sur résine échangeuse d'ions

Le dispositif reste le même : un tampon d'élution est versé sur une solution d'aminoacides (libres ou sous formes de peptides) contenue en haut d'une colonne avec résine. Cette résine est un polymère de silice greffé avec des macromolécules insolubles aux groupements ionisés. Ces groupements vont pouvoir réversiblement échanger leurs ions mobiles contre des ions de même charge venant de la solution.

Une résine cationique échangeuse d'anions fractionnera les protéines à pH élevé. Or à pH élevé, les protéines acides sont fortement dissociées (les formes anions COO- sont majoritaires par rapport aux radicaux COOH).
Elles sont donc fortement fixées à la résine. Les protéines basiques, peu anioniques, vont, au contraire, passer très rapidement, sans se fixer à la colonne.
c'est donc une diminution progressive du pH de la phase mobile qui permet l'élution des protéines neutres puis acides.

Les protéines sortent dans l'ordre inverse de leur affinité pour la résine.

Une résine anionique échangeuse de cations fonctionnera de la même façon, mais ce sont les protéines basiques (formes "RNH3+" majoritaires par rapport aux radicaux RNH2) qui se fixent fortement à la résine. Sortent donc en premier les molécules acides, puis les neutres et enfin les basiques. On élue donc à pH faible en l'augmentant.

Les protéines sortent dans l'ordre inverse de leur affinité pour la résine.

L'augmentation de la concentration saline se traduit par une augmentation des ions du tampon qui vont donc entrer en compétition avec les protéines pour s'accrocher à la résine.

L'augmentation de la concentration saline va donc favoriser le décrochage.

2.5. Méthodes basées sur des différences de Poids Moléculaire

2.5.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - SDS

Le sodium-dodecyl-sulfate est un détergent très puissant, très hydrophobe, qui rompt les liaisons non covalentes. La protéine est dénaturée mais de façon réversible. Un complexe SDS - protéine dénaturée se forme et comporte une charge négative colossale (à peu près proportionnelle à la longueur de la chaîne). La charge nette de la protéine devient donc négligeable et seul le poids moléculaire apparait déterminant. Afin de conforter cette idée, du mercapto-éthanol est ajouté pour rompre les ponts disulfures.
Est alors réalisé une électrophorèse verticale sur gel de polyacrylamide. C'est ce gel qui va alors permettre les migrations différentes entre protéines. Il contient des mailles et peut donc jouer ainsi un rôle de tamis : le gel freine les protéines proportionnellement à leur taille (PM). Les protéines les plus grosses restent proches de leur point de dépôt alors que les petites protéines migrent très loin. La révélation se fera à l'argent ou au bleu de coomassie, révélant une série de bandes.
La mobilité est inversement proportionnelle à la masse. On dit que la mobilité des protéines est linéairement proportionnelle au logarithme de leur masse. Il devient donc possible de déterminer le poids de protéines par comparaison avec un mélange d'étalonnage : le marqueur de poids moléculaire.

2.5.2. Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel

C'est l'inverse de l'électrophorèse dans le sens où ce sont les petites protéines qui seront freinées. En fait le gel de Séphadex (ou polyacrylamide) est formé de grains gonflant dans l'eau.
Comme il s'agit d'une chromatographie, on retrouve le dispositif en colonne. En assimilant les protéines à des particules sphériques on comprend rapidement que les petites protéines vont pénétrer les grains de Séphadex et avoir une migration retardée. Au contraire, les protéines dont la taille est supérieure à celle des plus gros pores du gel de Séphadex quitteront la colonne en premier.

Plus le PM est important, moins la quantité d'éluant utilisée sera importante, et inversement.

2.6. Chromatographie d'affinité

Elle est basée sur des interactions spécifiques entre deux molécules comme une protéine et son ligand. Dans une colonne on fixe sur un support inerte de façon covalente un ligand. On fait passer dans la colonne une solution contenant plusieurs protéines. La formation d'un complexe stable mais réversible permet de déterminer la protéine ayant de l'affinité pour ce ligand.
En modifiant les conditions d'élution, on décroche la protéine qui sera récupérée et étudiée.
C'est en général la dernière étape d'un processus de purification car technique fine et onéreuse.

2.7. Propriétés antigéniques

Les antigènes sont des protéines nécessitant une réponse immunitaire, donc répondant au modèle ligand-protéine. Le ligand, ici, sera un anticorps (immunoglobuline du sérum), ce sont les réactions immunologiques classiques. Comme pour toutes autres modèles enzymes - protéines, la reconnaissance se fait par complémentarité des surfaces et le point d'équivalence correspond à la proportion d'antigène et d'anticorps pour laquelle la combinaison est complète. Beaucoup de méthodes permettent de révéler un antigène lorsqu'on connait l'anticorps spécifique.
L'immunoprécipitation permet une combinaison antigène-anticorps in vitro précipitant au point d'équivalence. On pourra ainsi récupérer l'antigène par centrifugation. La chromatographie d'affinité et les dosages ELISA sont également utilisés.

2.8. Critères de pureté

Lorsqu'on purifie et étudie une protéine pour la première fois, ses propriétes sont toutes à déterminer. On commence par obtenir un extrait par dialyse, filtration. Puis sont testés : le pHi, le PM. Ensuite est réalisé une chromatographie d'affinité et l'on peut alors déterminer si l'on a obtenu une protéine pure ou pas selon une convergence de preuves indiquant la qualité de la séparation.

3. Détermination de la séquence en acides aminés d'un peptide ou protéine.

Pour avoir la composition brute en acides aminés d'une protéine pure, selon un schéma général, on procéde comme suit :

3.1. Détermination de la composition brute

A chaud, on réalise une hydrolyse acide par l'HCl 6N pendant 24 à 48 heures.
Les aminoacides sont libérés par rupture des liaisons peptidiques. Cette méthode détruit le tryptophane. La solution obtenue est étudiée en chromatographie sur résine échangeuse d'ions.
Le résultat paraît sous forme de pourcentage d'acides aminés.

3.2. Détermination des acides aminés terminaux

L'amino-peptidase et la carboxy-peptidase rompent les liaisons voisines des acides aminés N-terminal (le seul NH2 libre de la chaîne) et C-terminal (dernier acide aminé de la chaîne).
Les deux acides aminés sont identifiés en chromatographie d'échanges d'ions.

3.3. Analyse de la séquence - analyse récurrente d'Edman

C'est la seule méthode existant actuellement, elle nécessite l'isothiocyanate de phényl (ITCP). Ce composé va s'associer à la fonction aminée d'un résidu amino-terminal. Un dérivé cyclique est alors formé et va se détacher du peptide. C'est ce dérivé qui va être identifié en chromatographie échangeuse d'ions. On est donc à peptide n-1. Il est apparu un nouvel aminoacide terminal qui va à son tour être associer à un ITCP... La méthode récurrente d'Edman peut donc permettre de déterminer jusqu'à 50 acides aminés environ et est effectuée par des séquenceurs automatiques.

3.4. Clivage en peptides plus petits

De ce que l'on vient de voir, il semble donc évident qu'il faut découper la protéine en peptides d'environ 50 résidus aminoacides. Ces clivages seront donc réalisés en des endroits précis supposés régulièrement répartis.

3.4.1. Hydrolyse chimique

Une rupture peut être effectuée après chaque méthionine (donc du côté carboxylique) par le bromure de cyanogène.

3.4.2. Hydrolyse enzymatique

La trypsine clive les liaisons peptidiques du côté carboxylique des acides aminés lysine et arginine (coupure des liaisons lysil et arginyl).
La pepsine clive les liaisons, côté carboxylique, de la glutamine.
La chymotrypsine clive les liaisons, côté carboxylique, de la tyrosine.

Il faut réaliser ces clivages sur différents aliquotes pour obtenir 2 ou 3 patrons de coupe différents dans la protéine.

3.5. Reconstitution de la séquence protéique

On connait donc les 2 acides aminés terminaux et des analyses des recouvrements de séquence des familles de peptide étudié par la méthode récurrente d'Edman. La séquence est déterminée en étudiant les chevauchements des séquences partielles obtenues.

4. Méthode d'évaluation globale de toutes les protéines présentes dans une cellule en un instant précis.

L'ensemble des protéines d'une cellule ou d'un tissu dans un état physiologique particulier constitue le protéome. Il y a 2000 à 10 000 protéomes pour un gènome. Pour identifier ces protéomes, deux techniques sont utilisées : électrophorèse bidimensionnelle + cartographie exhaustive des protéines +/- identification en spectrophotométrie de masse.

L'électrophorèse bidimensionnelle, méthode protéomique, utilise deux critères de séparation des protéines: PM et pHi.
L'isoélectrofocalisation est la première étape de cette électrophorèse. Le dispositif est composé d'un gel cylindrique (ou en bandelette) possédant un gradient (pH 4 à 10 par exemple), le plus élevé étant en haut du cylindre. Le nom de cette technique se justifie par le fait que les protéines se focalisent à leur point isoélectrique : iso-électro-focalisation.

Le cylindre d'électrophorèse est secondairement placé à l'horizontal. Il va être assimilé à un support de dépôt pour une seconde électrophoèse. Ici les protéines vont migrer selon leur PM sur un gel de polyacrylamide-SDS.
Le résultat des deux électrophorèses présente un ensemble de spots protéiques individualisés, une cartographie protéonomique.
En ordonnée on aura donc le PM des protéines et en abscisse, on a leur pHi.
La spectrophotométrie de masse est utilisée pour identifier la protéine étudiée. On va bombarder les peptides avec un laser, ce qui va leur donner une certaine énergie leur permettant de "voler" dans l'enceinte. Le temps de vol est proportionnel à leur masse, sa mesure est très précise permettant de mesurer une différence de quelques atomes.

5. Méthodes d'étude des protéines utilisées pour le diagnostic biologique

Elles présentent toutes un point commun : la nécessité d'une centrifugation initiale pour séparer cellules sanguines, plasma, sérum.

5.1. Dosage des protéines totales sériques

C'est la méthode du biuret qui est utilisée.
On détermine un taux de 60-70g/L de protéines circulantes dans le sang.

5.2. Electrophorèse des protéines du sérum pour anomalie de répartition

Elle se réalise sur gel d'agarose à pH 8,6 et est révélée au bleu colloïdal.
Les 100 protéines du sérum, suite aux résultats, sont séparées en 5 fractions :

5.3. Mise en évidence d'une protéine spécifique

Elle s'effectue par le western blot ou immunoblot.
Un extrait protéique est déposé sur un gel de polyacrylamide contenant du SDS et après électrophorèse, on transfére les protéines sur une membrane. Il y a alors mise en présence de l'anticorps spécifique marqué par un fluorochrome (ou autre).

5.4. Dosage d'une protéine spécifique dans le plasma

Le dosage quantitatif est fréquemment réalisé par la méthode Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay : ELISA. Sur un support solide est fixé un premier anticorps.
Il va capturer la protéine qui lui est spécifique parmi le sérum. Suite à un lavage on ajoute un second anticorps couplé à un système de détection qui se fixera sur la protéine, révélant sa présence par addition du substrat.


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