Auteur Sujet: Etalonnage sur gel  (Lu 5708 fois)

Hors ligne Emma01

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Etalonnage sur gel
« le: 01 Décembre 2011 à 18:26:32 »
Bonjour !

En fait j'ai quelques petits problèmes de compréhension sur l'étape d'étalonnage pour le Southern blot.

Pour connaitre la taille des fragments après le Southern Blot il faut mesurer la distance de migration de chacun des fragments et se référer à la courbe d'étalonnage faite précédemment ? Cette courbe d'étalonnage comprend pour chaque distance de migration, la taille correspondante. Jusque là est ce que c'est juste ?
Je ne comprends pas vraiment comment on fait cette courbe d'étalonnage : en fait elle est faite à part, je veux dire qu'elle n'est pas faite sur le gel d'agarose qui sert directement pour le southern blot mais sur un autre gel d'agarose que l'on resortira simplement à la fin du southern blot pour faire correspondre migration et taille c'est ça ? Et cette courbe d'étalonnage on l'a fait comment : on prend différents fragments dont on connait la taille et on regarde le distance de migration de chacun des fragments de taille connu ?

Quelqu'un peut il me corriger ou m'apporter des précisions ? Merci d'avance !

Hors ligne Fafa

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Re : Etalonnage sur gel
« Réponse #1 le: 02 Décembre 2011 à 09:55:48 »
Salut!

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Pour connaitre la taille des fragments après le Southern Blot il faut mesurer la distance de migration de chacun des fragments et se référer à la courbe d'étalonnage faite précédemment ? Cette courbe d'étalonnage comprend pour chaque distance de migration, la taille correspondante. Jusque là est ce que c'est juste ?
Ca c'est bon. La séparation des fragments d'ADN se fait selon leur taille, leur poids moléculaire (avec un marqueur de PM). Les plus légers vont le plus loin, le plus vite.
Pour le reste, je ne vois pas trop ce que tu entends pas "courbe d'étalonnage" pour un Southern.
Une fois la migration faite, on peut colorer le gel avec du bromure d'étidium (intercalant fluorescent) pour visualiser sur une table à UV l'ADN génomique digéré (fragmenté sous forme double brin)sous la forme d'une longue trainée fluorescente, les hauts poids étant proche du puit et les bas PM plus loin. La fluorescence est proportionnelle à la quantité d'ADN.
Après interviennent les étapes de transfert du gel, hybridation moléculaire, exposition radiographique.

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