La Réplication

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Activation, mécanismes de la réplication, catalyseurs, erreurs de réplications, réparation de l'ADN, mutations Print

Sommaire

1. Définitions

Réplication : Synthèse d'ADN :

  • qui reproduit exactement le génome d'une cellule,
  • pour préparer la division de cette cellule.

Quand?

A chaque division cellulaire, au cours du cycle cellulaire.

Réplication et division cellulaires sont régulées de façon coordonnée.

Le cycle cellulaire :

Différentes phases de la vie d'une cellule : de sa naissance, à partir de la division d'une cellule mère, jusqu'a sa propre division en 2 cellules filles.

  • Bactérie : 1 million de paires de bases; 1 chromosome nucléaire
  • Humain : 3 milliards de paires de bases; 46 chromosomes nucléaires

2. Éléments nécessaires à la réplication

2.1. ADN parental

La double hélice d'ADN est séparée en 2 brins d'ADN parents;

Chacun d'eux sert de matrice pour la synthèse d'un nouveau brin d'ADN : le brin d'ADN fils. Ce brin restera lié au brin d'ADN parent;

La réplication produit 2 molécules d'ADN, chacune d'elles contient un brin parent et un brin fils : la réplication est semi conservatrice.

2.2. Nucléotides

  • bases pyrimidiques : C, T et puriques : A et G;
  • désoxyribose;
  • sous forme de désoxynucléotides triphosphates : dATP......;
  • apportant à la fois :
    • le substrat : le nucléoside monophosphate,
    • l'énergie pour relier chaque nucléotide au précédent.

2.3. Enzymes

  • ADN polymérases distinctes par :
  • leur localisation subcellulaire,
  • leur activité réplicative :
    • alpha : début de la réplication, associée à une primase,
    • delta : réplication du génome nucléaire;
    • gamma : réplication du génome mitochondrial;
    • beta : réparation de l'ADN;
    • epsilon : réplication des télomères;
  • nécessitent pour être actives de très nombreuses protéines accessoires.

2.4. Environnement

La phase S suit la phase G1 pendant laquelle la cellule a synthétisé tous les éléments nécessaires à cette réplication.

Présence de facteurs de croissances, des protéines, des nucléotides et autres nutriments.

3. Mécanisme

3.1. Origines de réplication

  • La réplication commence en de nombreux points ou "origines de réplication" le long du chromosome (environ 10000).
  • réplication complète (2 fois 3.109 paires de bases ) dans un temps limité environ 8H.
  • séquences nucléotidiques "ARS" (Autonomous Replicating Sequence);
  • reconnues par des protéines "ORC" (Compelxe de Reconnaissance de l'Origine);
  • définissent des unités de réplications indépendantes ou réplicons (30 à 300 pb)

ORC : complexes protéiques possédant une activité enzymatique de type ATPase. Ils utilisent l'hydrolyse de l'ATP comme source d'énergie pour :

  • se fixer sur les séquences ARS;
  • recruter d'autres protéines jusqu'a former une "machine moléculaire" capable de dérouler la double hélice d'ADN (par activation des hélicases).

3.2. Activation des origines de réplication

3.2.1. Complexe de pré-réplication

Au début de la phase G1, assemblage de protéines, hélicases, kinases cyclines dépendantes CDK (sous-unité kinase associée à une sous-unité cycline) encore inactives.

3.2.2. Complexe d'initiation : pendant la phase S

  1. Activation des CDK : phosphorylation et activation d'autres protéines;
  2. activation des hélicases : déroulent la double hélice d'ADN et séparent les 2 brins;
  3. recrutement des ADNpol et de leurs protéines accessoires.

Après l'initiation de la réplication :

  • ce complexe est démantelé,
  • l'origine de réplication passe à l'état "non compétent" jusqu'a la fin du cycle cellulaire.

Quand les cellules eucaryotes prolifèrent :

Les origines de réplications alternent entre un état "compétent" et un état "non compétent";
Il existe une coordination entre les multiples origines de réplications pour qu'elles ne soient compétentes qu'une seule fois au cours de chaque division cellulaire;
La réplication des différents réplicons sur le chromosome n'est pas totalement synchrone : elle intervient plus ou moins précocement pendant la phase S.

Au niveau de l'origine de réplication :

Le déroulement de l'ADN et la séparation des 2 brins font apparaître des régions d'ADN simple brin, stabilisées par des protéines RPA (protéines de réplications A), accessibles aux enzymes et protéines nécessaires à la réplication.

De chaque côté, le réplicon forme une "fourche de réplication" :

  • zone où les brins d'ADN sont déroulés et où chaque brin matrice reste simple brin pendant un temps très court.

A la fin de la réplication tous les réplicons confluent :

  • l'ensemble du génome est alors répliqué.
  • Le réplicon se propage simultanément :
    • à droite et à gauche de l'origine de réplication : sa propagation est bi-directionnelle;
    • sur chacun des 2 brins d'ADN matrices ou parents.

3.3. L'ADNpol δ

3.3.1 Dépend d'une amorce

  • Elle ne peut agir que si elle trouve une extrémité 3'OH libre sur lequel elle fixe un nouveau nucléotide.
  • L'amorce est synthétisée par l'ADNpol α - primase (primer = amorce) qui :
    • possède une activité ARNpol,
    • synthétise un court segment d'ARN (10 paires de bases);
    • puis synthétise un court segment d'ADN (20 paires de bases).

3.3.2. Synthétise l'ADN ds le sens 5' → 3'

  • L'ADNpol δ recrute un nucléoside triphosphate,
  • fixe son phosphate alpha en 5' à l'extrémité 3'OH libre de l'ADN en cours d'élongation,
  • forme une liaison phosphodiester,
  • synthétise un brin complémentaire et antiparallèle.

3.3.3. Lit le brin matrice ds le sens 3' → 5'

Au niveau de l'origine de réplication, la synthèse d'ADN commence simultanément :

  • à droite et à gauche;
  • et sur chacun des 2 brins

D'où : réplication de 2 brins 3' → 5' et 2 brins 5' → 3'.

les brins d'ADN 3' → 5' (à partir de l'origine de réplication, dans le sens de déplacement de la fourche de réplication) sont copiés de façon continue par l'ADNpol δ jusqu'à rencontrer une autre fourche de réplication progressant en sens inverse : c'est le brin continu ou avancé.

La réplication des brins d'ADN 5' → 3' est plus complexe : l'ADNpol δ synthétise le brin d'ADN fils dans le sens inverse du déplacement de la fourche de réplication. On appelle ce brin : le brin retardé ou discontinu.

Sur ce brin d'ADN 5' → 3', l'enzyme synthétise de multiples petits fragments d'ADN à la suite des amorces (pour chaque réplicon on compte jusqu'a 250 fragments), ce sont les "fragments d'Okazaki" (long d'environ 1000 à 5000 nucléotides).

Au fur et à mesure de la progression de la fourche de réplication :

  • des hélicases déroulent la double hélice d'ADN,
  • des topo- isomérases réduisent les torsions de l'ADN en amont de ces fourches.

Les enzymes topo-isomérases :

  • assurent le décompactage et le re-compactage de l'ADN lors de la réplication,
  • suppriment les contraintes de torsion de l'ADN occasionnées par la progression des fourches de réplication,
  • elles agissent par :
    1. liaison à l'ADN,
    2. coupure d'un brin d'ADN,
    3. rotation du brin coupé,
    4. re-ligation pour restaurer la continuité de l'ADN.

Selon les topo - isomérases (type I ou type II) il y a coupure d'un seul ou des 2 brins d'ADN. Après la réplication, l'ADN est immédiatement restructuré en nucléosome en utilisant des histones néosynthétisées.

3.3.4. ADNpol δ et synthèse simultanée des 2 brins d'ADN ?

L'ADNpol δ existerait sous forme de dimère : le brin continu formerait momentanément une boucle. Il y a synthèse simultanée des 2 brins, par étape, sur de courtes distances, celle des fragments d'Okazaki.

3.3.5. ADNpol δ

Elle remplace les séquences d'ARN des amorces qu'elle rencontre successivement au cours de sa progression par des fragments d'ADN.

3.3.5. L'ADN ligase

Elle relie les fragments d'ADN en établissant une liaison phosphodiester.

3.4. Réplication des télomères.

La réplication des brins d'ADN 5' -> 3' au sein des réplicons est plus complexe que celle des brins 3' → 5'. De plus, sur ces brins 5' → 3', du fait de la nécessité de la présence d'une amorce, la réplication des extrémités 3' terminales n'est pas possible.

Les ADNpol sont incapables de répliquer les extrémités 3' de chacun des 2 brins d'un chromosome : ces extrémités sont donc terminées par un simple brin d'ADN qui est finalement dégradé, les chromosomes sont raccourcis à chaque division cellulaire.

Les cellules eucaryotes disposent de télomères :

  • séquence 5'-- TTAGGG --3' aux 2 extrémités des chromosomes,
  • répétitives, non codantes,
  • "consommées" progressivement, à chaque division cellulaire,
  • rôles de protection des chromosomes évitant aux régions internes, fonctionnellement importantes, d'être supprimées.

On peut donc en conclure la possibilité pour les cellules de se diviser un certain nombre de fois, nombre limité par la longueur des télomères.

Ainsi, les cellules jeunes, qui se sont divisées un petit nombre de fois, possèdent de long télomères. Les cellules âgées, qui se sont divisées un grand nombre de fois, possèdent des télomères plus courts. Cependant, certaines cellules de notre organisme sont capables de se diviser un grand nombre de fois : elles disposent d'une enzyme active, la télomérase. Son rôle est d'allonger les télomères.

La télomèrase :

  • ajoute des copies de télomères 5'-- TTAGGG --3' aux extrémités 3' simple brin des chromosomes,
  • possède une courte séquence d'ARN incorporée dans sa protéine.

Cette séquence d'ARN :

  • s'apparie, par l'une de ses extrémités, à la séquence 3' d'ADN télomérique,
  • sert de matrice, par l'autre extrémité, pour la synthèse d'ADN télomérique.

La télomérase est une transcriptase inverse. La télomérase agit plusieurs fois en se translocant. Une primase fixe une amorce en 3' du brin allongé. Une ADNpol Délta synthétise le brin complémentaire. Une ligase lie les 2 brins (d'ADN fils).

La plupart des cellules somatiques humaines différenciées ont une télomérase inactive. Elles subissent donc une érosion de leur ADN télomérique et le nombre de leurs divisions est limité.

Les télomères humains sont prévus pour se raccourcir d'environ 100 paires de bases par division cellulaire et lorsque la perte atteint plusieurs milliers de bases, les cellules cessent de se diviser et entrant en sénescence : c'est le vieillissement.

Au contraire, la télomérase est active :

  • dans les cellules souches embryonnaires : ces cellules se divisent très activement au début de la vie de l'individu lors de la formation des organes;
  • dans les cellules souches (moelle osseuse...) : ces cellules se divisent indéfiniment toute la vie de l'individu;
  • dans les cellules tumorales : mécanisme pathologique de prolifération anarchique.

Les télomères ont également un rôle dans la stabilité des chromosomes : le vieillissement cellulaire favorise l'instabilité génétique.

3.5. Fidélité de la réplication

La fidélité de la réplication n'est pas absolue : il existe des erreurs d'appariement de bases.

Les ADNpol δ peuvent corriger ces erreurs car elles possèdent des activités exonucléasiques 3' → 5'.

D'autres mécanismes de correction existent réduisant potentiellement les risques de non respect de la réplication : l'erreur est limitée à ≈ 1/109

L'activité exonucléasique 3' → 5' des ADNpol δ permet de :

  • relire le dernier nucléotide mis en place : vérification des règles d'appariement,
  • retirer le nucléotide en cas de mauvais appariement,
  • rajouter le nucléotide approprié, avant de poursuivre la réplication.

Les ADN pol δ possèdent 2 types d'activités exonucléasique :

  • une activité exonucléasique 3' → 5' : corrige les mésappariements,
  • une activité exonucléasique 5' → 3' : remplace l'ARN des amorces.

3.6. Réplication chez les différents organismes vivants

Les grands principes de la réplication sont les mêmes chez les eucaryotes et les procaryotes. Cependant chez les eucaryotes la réplication :

  • reste un événement plus rare,
  • s'inscrit à un moment précis du cycle cellulaire,
  • possède un degré supérieur de complexité (organisation de l'ADN en chromatine),
  • possède de multiples origines de réplications.

4. Intérêt médical

  1. Une meilleure connaissance des mécanismes physiologiques permet une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques.
  2. Cela se traduit par une mise en évidence de nouvelles cibles pour de nouveaux médicaments.

Exemple1 : Anticancéreux inhibant la réplication de l'ADN.

  • les alkylants : forment des ponts stables par liaison covalente entre les 2 brins d'ADN;
  • les intercalants : s'insèrent entre 2 paires de bases consécutives de l'ADN : éloignement de ces bases : cassures des brins d'ADN;
  • les inhibiteurs des topo-isomérases : stabilisent les coupures transitoires d'ADN : ils s'opposent à la re-ligation des brins d'ADN.

Exemple 2 : la famille des gènes de globine

4.1. Organisation des gènes

Les gènes de globine sont :

  • répartis sur 2 chromosomes différents :
    • chromosome 16 : gènes de la famille α
    • chromosome 11 : gènes de la famille β
  • tous constitués de 3 exons séparés par 2 introns

Il existe une stricte colinéarité entre :

  • les exons sur les gènes,
  • les codons sur le transcrit primaire et l'ARNm,
  • et la protéine correspondante.

L'enchaînement des acides aminés dans la protéine est l'exacte traduction de l'enchaînement des nucléotides dans les exons du gène.

Il y a 4 gènes de globine de la famille α :

  • ζ
  • α 1 et α 2
  • θ (période embryonnaire)

Les gènes α 1 et α 2 : les 3 exons sont totalement identiques, globines α 1 et α 2 identiques

Gènes de globine de la famille : La taille de chacun des 3 exons des 5 gènes est identique : la taille des 5 protéines est identique.

4.2. Expression des gènes

  • hémoglobine synthétisée : θ 2 ε 2 : embryon,
  • vie foetale : HbF : α 2 γ 2
  • vie extra-utérine :
    • HbA : α 2 β 2 (97%)
    • HbA2 : α 2 δ 2 (2%)
    • HbF : α 2 γ 2 (1%)

4.3. Régulation de l'expression des gènes de globine

Expression "tissu-spécifique" :

  • rate / vie foetale
  • moelle osseuse/vie extra-utérine

Expression coordonnée entre les 2 familles de gènes => synthèse d'autant de protéines de la famille α que de la famille β.

D'où complexité supplémentaire dans la cellule adulte : 2 chromosomes 16 porteurs de α 1 et α 2 (=> 4 gènes alpha) et 2 chromosomes 11 porteurs de β (=> 2 gènes béta ).

Expression coordonnée pour permettre une activité séquentielle des gènes : commutation (switch) de l'expression :

  • dans la famille α : gène θ / embryon => alpha adulte
  • ds la famille β : gène ε / embryon = γ / foetus => β /adulte

Intérêt de cette commutation à l'origine de l'existence de différentes Hb : l'HbF a une plus forte affinité pour l'O2 que l'HbA → elle facilite les transferts d'O2 de la mère vers le foetus.

4.4. Exemple de pathologies des gènes

Les mutations sur les gènes de la globine sont très fréquentes.

Exemple de mutation à l'origine de maladie : la drépanocytose :

  • maladie héréditaire autosomale récessive,
  • substitution sur le 6ième codon du gène β de la globine : GAG → GTG => protéine β anormale : glu => val. On obtient une HbS donc des conséquences physiopathologiques.

Chez le malade homozygote, la modification de la structure de la protéine entraîne :

  • une modification de l'affinité pour l'O2,
  • une modification de la solubilité de la protéine : cristaux qui s'agrègent => destruction de la membrane des globules rouges = anémie. cristaux allongés constitués par des polymères d'hémoglobine => déformation du globule rouge, forme caractéristique en faucille.

Chez le sujet transmetteur de la maladie, hétérozygote :

  • Le gène sain produit suffisamment de protéine normale pour contrebalancer les effets du gène anormal.
  • Effet bénéfique de la mutation d'un seul gène : confère la résistance au paludisme : le parasite qui pénètre ds le globule rouge où l'hémoglobine est fragilisée ne trouve pas les conditions de son développement = mort du parasite.

4.5. Altération de l'ADN

L'ADN subit des altérations :

  • en permanence,
  • spontanément ou par des agents endo/exogènes,
  • dans des cellules somatiques et ds des cellules germinales.

4.5.1. Agents physiques

  • Rayonnements radioactifs : Ils sont responsables de modifications de la structure des nucléotides et de la cassure des brins d'ADN. Cela explique l'existence de risques pour le personnel en radiologie et les risques dus à une multiplication des radiologies pour les patients.
  • Rayons U.V : Ils sont caractérisés par une dimérisation de 2 bases pyrimidiques contiguës ce qui a pour entraîne :
    • la formation d'une liaison covalente intra-brin,
    • une distorsion locale de l'ADN.
  • Finalement on a une ADN pol inefficace d'où un arrêt de la réplication (1H d'exposition au soleil = 60000 dimères par cellules).

4.5.2. Agents chimiques

  • exogènes (environnement...),
  • endogènes, issus du métabolisme de la cellule : les radicaux libres, les ions H+ dans des conditions physiologiques peuvent entraîner la perte de bases. (perte d'environ 10000 bases par jour et par cellule chez l'Homme).
  • modifications, exemples : nucléotides dépurinés, bases désaminées, oxydation...

4.5.3. Altérations spontanées du fait d'instabilité chimique

Les bases nucléotidiques libres peuvent exister sous 2 formes tautomères :

  • adénine et cytosine peuvent exister sous forme amino et imino,
  • guanine et thymine peuvent exister sous forme céto et énol.

A pH physiologique, les formes amino "C-NH2" et céto "C=O" prédominent dans l'ADN. Cependant les formes imino et énol peuvent apparaître à la suite d'une tautomèrisation spontanée. Au cours de la réplication ou de la transcription suivante, elles n'établissent pas les mêmes liaisons préférentielles que les formes amino et céto, on a des appariements illégitimes.

4.5.4. Virus

Différents virus sont capables d'interférer sur le génome des cellules hôtes qu'ils ont infectées, cela peut entraîner :

  • une sur-expression ou sous-expression de certains gènes régulateurs de la division cellulaire,
  • la production d'une cellule tumorale.

4.5.5. Erreurs de réplication

Les ADNpol δ commettent fréquemment des erreurs : la plupart de celles-ci sont aussitôt réparées par leur activité exonucléasique 3' → 5'. Au final le taux d'erreur et très faible : environ 1 erreur par génome dupliqué.

4.6. Réparation de l'ADN

4.6.1 Mécanismes de réparation

Des mécanismes de réparation contrôlent chaque instant de la vie cellulaire de façon à maintenir l'intégrité de l'ADN face aux agressions.

Réparation de nucléotides anormaux :

  • Elle se fait par excision-resynthèse,
  • le brin complémentaire sert de matrice.

Réparation des cassures double brin :

  • soit par jonction des 2 extrémités cassées : rapiéçage,
  • soit par réparation homologue : échange d'information entre la région à réparer et la région homologue située :
    • sur la chromatide soeur synthétisée pendant la phase S,
    • ou sur le 2ième chromosome homologue de la paire : c'est le principe de la recombinaison homologue.

Cependant, ces altérations de l'ADN ne sont pas toutes corrigées, il en persiste un certain nombre qui modifie l'ADN de façon stable : ce sont les mutations.

4.6.2 Mutations

Ce sont les modifications par substitution, addition, délétion d'un ou plusieurs nucléotides au sein du génome.

Conséquences des mutations : elles sont diverses selon la nature et selon la localisation dans le génome.

  • mutation bénéfique : l'existence d'un certain taux de mutation est à l'origine d'une variabilité de l'info génétique :
    • maintien de la diversité biologique
    • rôle dans les mécanismes évolutifs.
  • Mutations indifférentes
    • silencieuse : la substitution d'un nucléotide dans un codon peut aboutir au codage d'un autre acide aminé (ou de même acide aminé si elle affecte la 3ième position du codon) sans modifier la fonction de la protéine,
    • dans les introns : en dehors des sites consensus d'épissage, sans conséquences,
    • dans les autres régions non codantes, en dehors des promoteurs, sans conséquences,
    • mortelle : elles aboutissent à la mort de la cellule sans affecter le reste de l'organisme.
  • Mutations délétères :
    • dans une cellule germinale : maladie génétique héréditaire, la copie du gène altéré étant transmise de génération en génération,
    • dans une cellule somatique : l'accumulation d'un certain nombre de mutation peut conduire au cancer.

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